不对称氢化是合成中获得手性分子砌块的重要手段，在工业界和学术界均有着广泛的应用。实践中，催化的不对称氢化过程已经得到长足的发展。相较于广泛应用的化学氢化体系，生物催化的烯烃氢化过程同样备受关注，并且已经展现出较好的应用能力。目前已知的最具代表性且被广泛研究的烯烃还原系统是基于黄素依赖型蛋白的烯烃还原酶（ene-reductase）。这类酶催化剂主要依赖还原态的FMN辅因子进行碳碳双键的还原，其底物范围局限于缺电子的烯烃，如α,β-不饱和的醛酮、酯、酰胺等取代类型，反应的机制一般经由协同的氢负转移过程。这一催化机制实际上限制了这类酶催化烯烃还原的底物类型。

为了突破上述生物催化体系的机制限制，拓展酶促不对称氢化反应的底物范围，近年来不少课题组进行了重要的尝试。然而能够直接氢化取代苯乙烯（styrenes）以及非共轭烯烃（aliphatic alkenes）的催化体系仍然非常少见。为了拓展生物催化不对称氢化的底物空间，实现更加普适的氢化方法，探索并改造不同类型的金属酶进行该类化学转化显然具有重要的酶学研究价值与潜在应用前景。

图1.定向进化历程及氨基酸残基位置

近期，清华大学生物医学交叉研究院刘臻实验室和南方科技大学陶丽芝团队、加拿大Mila人工智能研究所唐建团队合作，以1，1-二取代苯乙烯为模版底物对于酶促的烯烃还原反应进行了酶活筛选和条件优化。研究发现，一种来自Gluconobacter oxydans 621H的氨基酸加氧酶GOX展示出微弱的苯乙烯不对称氢化活性（其在最优反应条件下仅催化约2.8%的产物生成率），且反应手性选择性也仅有17%ee值。

为了提高这一蛋白的催化性能，实验人员凭借传统的筛选策略结合计算辅助的位点预测等一系列手段进行了酶的工程化改造。最终，在经过长达6轮的定向进化并且筛选超过560个突变体文库的迭代过程后，研究团队将16个有益突变引入GOX野生型序列，最终将这一氧化酶改造为兼具活性与高对映选择性的烯烃还原酶（AHase-6）。由于这类酶催化剂前期的稳定性较低、整体可改造性一般，针对其进行的优化与筛选过程大约持续了一年半之久。

图2.反应机理研究

在确定最终变体后，研究人员随后对反应适用的底物谱开展了探索。尽管部分取代的苯乙烯类型底物反应活性有所降低，大部分底物仍然能够以中等至良好的手性选择性（44-93%ee）完成不对称氢化反应。除苯乙烯类型的烯烃之外，反应还可以兼容含缺电子双键的底物，如α,β-不饱和腈以及酰胺等化合物。这类底物的反应活性比普通苯乙烯效率更高，因此可以获得接近定量的产物生成率。同时实验人员选择了代表性底物进行了0.3-0.8mmol底物量级的放大，并取得了与分析量级反应相当的分离效果。值得注意的是，这一催化体系还可以拓展到还原非共轭的惰性烯烃。这类底物的反应性受烯烃的位阻效应影响，表现出随着烯烃取代的程度增加而下降的趋势，因此需要通过后续更加完整的定向进化来进一步提高酶催化效率与反应手性控制能力。最后，研究人员进行了一系列机理研究工作。实验团队分别通过单点突变实验、米氏动力学实验、自由基探针实验等方法，以及电子顺子共振波谱（EPR）实验对这一非血红素铁酶催化的烯烃还原反应进行了深入了研究，并基于实验结果提出了相应的催化机制。实验室后续的研究工作将聚焦于这类氢化反应效率的持续提升以及包括蛋白晶体结构解析在内的机制研究方面。

研究成果以“人工改造非血红素铁酶用于烯烃的不对称氢化反应研究”（Engineered Nonheme Iron Enzymes Enable Asymmetric Hydrogenation of Alkenes）为题，于6月13日发表于《美国化学会志》（Journal of the American Chemical Society,JACS）。

清华大学生物医学交叉研究院刘臻实验室2023级博士生何云飞为论文第一作者。清华大学生物医学交叉研究院研究员刘臻、南方科技大学教授陶丽芝、加拿大Mila人工智能研究所唐建博士为论文共同通讯作者。研究得到科技部、北京市昌平区“U35培苗资助计划”、化学生物协同物质创制全国重点实验室开放课题基金、清华大学生物医学交叉研究院、北京生命科学研究所等项目和机构的支持。

论文链接：

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.6c08443

供稿：生物医学交叉研究院

编辑：李华山

审核：郭玲