近日，清华大学生物医学交叉研究院董梦秋实验室联合北京生命科学研究所（北生所）化学中心团队、中国科学院计算技术研究所贺思敏研究员团队，全面、系统地评估了不可断裂交联剂DSS与可断裂交联剂DSSO在交联质谱实验中的性能，找到了影响交联鉴定的底层因素，以直接可比的实验数据澄清了领域内长期存在的争议，为交联剂的选择提供了更具实践性的指导。

交联质谱技术（chemical cross-linking of proteins coupled with mass spectrometry analysis）是解析蛋白质及蛋白复合体三维结构的常用工具，同时也具备绘制全蛋白质组相互作用图谱的潜力。作为该领域的先行者，董梦秋实验室长期与计算科学、有机合成、蛋白质科学等领域的研究团队密切合作，全方位推动交联质谱技术的发展，包括开发了全球广泛使用的pLink系列软件、推出了新型交联剂并拓展了交联质谱的应用范围。

近年来，绘制蛋白质组相互作用图谱成为交联质谱技术发展的主要驱动力，以DSSO为代表的可断裂交联剂被寄予厚望。这源于一种流行的观点：DSSO交联肽段因交联臂断裂产生质量相差32Da的特征离子对，可用于过滤大量候选肽段组合，从而缩小数据库搜索空间，因此被视为解析高复杂度互作组学样本的首选。2022年朱里·拉普西尔伯（Juri Rappsilber）实验室在《分析化学》（Analytical Chemistry）上发表的论文质疑了这一观点，提出DSSO的首要优势在于其交联肽段骨架碎裂更完整。然而，不可断裂交联剂（如DSS）与可断裂交联剂（如DSSO）孰优孰劣仍无定论。针对这一问题，并考虑到DSSO工作流程的多样性，研究团队首先对DSSO流程进行了细致优化，在确认最优条件后，使用四类不同复杂度的样本（从纯化蛋白到哺乳动物全细胞裂解液）对DSS和DSSO进行了严谨、全面的基准测试与对比。

研究发现，DSS因其更长、更灵活的交联臂，拥有比DSSO大40%以上的“捕获”空间，对应到交联肽段对的鉴定数，从纯化蛋白到细菌裂解液，DSS都以绝对优势超出DSSO，且这一优势与化学反应性或质谱可断裂性无关。DSS在交联肽段对鉴定数量上的优势随样本复杂度增加而降低，在哺乳动物全细胞裂解液样本上被DSSO反超，其根本原因在于交联肽段的碎片离子覆盖率——DSSO略高于DSS，支持了拉普西尔伯团队2022年的判断。另外，碎片离子覆盖率在蛋白互作组图谱绘制中尤为关键，只要交联肽段的碎片离子覆盖率达到85%或以上，无论使用哪种交联剂，交联肽段对的鉴定灵敏度都不会因搜索空间的急剧膨胀而受损。

交联质谱技术解析蛋白质及蛋白复合体三维结构

此前，董梦秋实验室曹勇博士还澄清了交联质谱领域的另一个争论：DSS、DSSO以及其他基于N-羟基琥珀酰亚胺酯（NHS ester）的交联剂除了靶向赖氨酸（K）与蛋白质N端，是否还与丝氨酸、苏氨酸与酪氨酸（STY）侧链的羟基反应。通过将不可能与NHS ester反应的甘氨酸、缬氨酸与亮氨酸（GVL）设置为可交联位点来估算错误位点鉴定，他发现鉴定结果中STY交联与GVL交联的可靠性相近。进一步分析表明，绝大部分STY交联实际上是定位有误的K-K交联，其余则多为容易导致假阳性匹配的短肽段交联。因此，在现有交联搜索引擎条件下，不宜将STY设为可交联位点。

综合上述研究，研究团队澄清了交联质谱领域长期存在的几个误区，并为交联质谱实验提出三点明确建议：第一，对于复杂度不超过细菌裂解液的蛋白质样本，优先推荐使用DSS交联剂；第二，对于极高复杂度的哺乳动物蛋白组互作分析，目前的交联剂尚难以胜任，但采用DSSO交联结合预分级技术可获得相对更优的鉴定结果；第三，在搜索数据时，不建议将STY设为NHS ester交联剂的可交联位点。

研究成果以“切割或不切割：DSS与DSSO在交联质谱分析中的系统评估”（To cleave or not to cleave：a systemic evaluation of DSS versus DSSO for cross-linking mass spectrometry analysis）为题，于6月9日发表于《分子系统生物学》（Molecular Systems Biology）。

清华大学生物医学交叉研究院董梦秋实验室曹勇博士，中国科学院计算技术研究所毛鹏志博士、陈镇霖博士，北京生命科学研究所（北生所）化学中心管理员吴青翠为论文共同第一作者。清华大学生物医学交叉研究院副教授董梦秋、齐湘兵，中国科学院计算技术研究所研究员贺思敏为论文通讯作者。

研究得到国家重点研发计划、国家自然科学基金、北京市自然科学基金等的资助。

论文链接：

https://doi.org/10.1038/s44320-026-00222-9

供稿：生物医学交叉研究院

编辑：李华山

审核：郭玲