华中科技大学生命学院李一伟刘笔锋团队发现高通量鉴定内源性相分离蛋白新方法

2月12日，生命学院李一伟教授和刘笔锋教授团队在国际方法学期刊《自然·实验手册》（Nature Protocols）在线发表了题为“High-throughput identification of endogenous biomolecular condensates and phase-separating proteins”的研究论文。

该研究（Protocol）巧妙结合了外界刺激诱导（渗透压压缩或TGF-β处理）、蔗糖密度梯度离心与定量质谱技术。其核心原理在于：利用相分离蛋白在形成凝聚体并发生寡聚化时产生的密度变化特征，实现了复杂细胞环境中的精准分离与系统分析。

液-液相分离（Liquid-liquid phase separation, LLPS）驱动的生物大分子凝聚体在调节基因表达、信号传导等各项生命活动中发挥着枢纽作用，其功能失调往往与癌症、神经退行性疾病等密切相关。然而，在复杂的内源性环境中精准鉴定相分离蛋白，一直是该领域面临的重大技术瓶颈。传统的鉴定方法主要依赖于体外纯化重组蛋白的相分离实验。这种方式不仅通量极低、耗时耗力，更致命的是，它完全脱离了真实的细胞微环境，无法真实再现蛋白质在细胞内复杂的翻译后修饰、分子拥挤效应以及错综复杂的互作网络。 另一方面，现有的部分高通量筛选策略（如依赖特定标记的流式分选、基于 RNase 的溶解度分析等）往往需要提前预知靶标进行基因组修饰，或容易破坏细胞的原生状态，且通常只能鉴定出特定亚群（如依赖 RNA 的相分离蛋白）。更为棘手的是，细胞内的生物大分子凝聚体往往具有高度动态、瞬时和纳米级的物理特征。当细胞应对外界复杂的生理或病理刺激（如渗透压应激、信号传导等）时，现有的技术极难系统性地捕捉到那些低丰度蛋白所发生的瞬时、动态相分离响应过程。

运用该方法，研究团队在 H1975 细胞系中进行了概念验证，在渗透压压缩或 TGF-β 处理条件下，成功鉴定出超过 1500 种相分离蛋白。值得高度关注的是，其中有 538 种候选蛋白是现有相分离体内外多组学数据库（PhaSepDB）尚未收录的新发现。 实验证实，该方案不仅能够有效检测细胞内稳定存在的组成型凝聚体，还能极其灵敏地捕捉到响应渗透压应激或 TGF-β 信号转导而发生动态相分离的关键靶点。

该项研究成果为科研人员在全蛋白质组学水平上探究各种复杂生物学过程及疾病模型中的相分离机制，提供了标准化且极具扩展性的操作规范，在基础生命科学与疾病靶点发现等领域具有广阔的应用前景。

图为高通量鉴定内源性生物大分子凝聚体和相分离蛋白的流程图。

华中科技大学生命学院博士后李鹏杰为该论文的第一作者，李一伟教授和刘笔锋教授为论文的共同通讯作者。华中科技大学生命科学与技术学院为该论文的唯一完成单位。该研究工作得到了国家自然科学基金、中央高校基本科研业务费专项资金以及中国博士后科学基金的资助。

论文链接： https://doi.org/10.1038/s41596-025-01327-5