甲醇芽孢杆菌合成生物学使能技术获进展

近日，中国科学院天津工业生物技术研究所研究团队开发了一套甲醇芽孢杆菌合成生物学使能技术：包括高效DNA电转化方法、基于热稳定CRISPR-Cas9系统的基因组编辑技术、用于基因稳定表达染色体中性位点，以及用户友好生物设计工具。团队利用该工具包解析了甲醇芽孢杆菌，质粒依赖型甲醇代谢遗传机制等基础科学问题，构建了无质粒、表型稳定的工程底盘，并通过改造底盘实现了以甲醇为唯一碳源生产L-精氨酸。

团队研究优化了甲醇芽孢杆菌DNA电转化方法，将转化效率较原方法提升1000倍，为遗传操作奠定了基础。研究进一步通过比较不同热稳定CRISPR-Cas9系统的PAM在甲醇芽孢杆菌基因组上的数量和分布，选择ThermoCas9进行基因编辑测试。结果表明，该系统具有超过98%的靶向致死率，使用1kb同源臂能够实现高效基因组敲除，敲除4kb以内片段效率接近100%，实现了40kb大片段敲除以及双基因同时敲除。

研究利用该系统，敲除了甲醇芽孢杆菌内源质粒pBM19和pBM69，以及染色体上的甲醇代谢基因拷贝，并剖析了它们在甲基营养和限制性修饰中的生理功能。结果表明，pBM19质粒携带6个甲醇代谢基因，质粒敲除菌完全丧失了在甲醇无机盐培养基中生长的能力，而携带限制性内切酶BmeTI的pBM69质粒敲除菌可以提高无m6A甲基化质粒转化效率。研究发现染色体拷贝的3-己酮糖-6-磷酸合成酶编码基因hps、6-磷酸-3-己酮糖异构酶编码基因phi，以及磷酸果糖激酶编码基因pfk的单敲除菌株几乎完全阻断了甲醇代谢，表明染色体拷贝的基因对甲醇代谢的重要性。

团队鉴定和评估12个用于基因稳定整合和表达的染色体中性位点。发现它们在不同条件下对菌体生长影响较小，具有不同表达水平，为基因表达精细调控提供了广泛选择。研究将对甲醇代谢至关重要的19kb大质粒pBM19整合至中性位点进行表达，同时敲除内源质粒，获得了无质粒新型工程底盘。该底盘通过适应性进化，展现出稳定且强健的生长特性，避免了质粒丢失风险，也消除了菌株退化隐患。

研究利用该模型模拟预测了甲醇芽孢杆菌代谢甲醇合成L-精氨酸的代谢途径，并通过基因敲除和过表达研究了L-精氨酸合成调控机制，构建得到利用甲醇生产L-精氨酸初代工程菌。

相关研究成果发表在《细胞报告》（Cell Reports）上。研究工作得到国家重点研发计划和国家自然科学基金等的支持。

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甲醇芽孢杆菌的合成生物学使能技术