上海交大王平课题组Angew发文：pH与波长协同调控的吡啶甲基策略助力半胱氨酸精准保护与蛋白质合成

半胱氨酸（Cys）凭借其独特的巯基，在调控蛋白质结构、功能及活性中扮演关键角色。在自然化学连接（NCL）和蛋白质工程等合成生物学领域，实现Cys残基的精确保护和可控释放至关重要。传统光保护基（如硝基苄基、香豆素、芳香酮、喹啉等）虽然可控，但普遍存在合成复杂、生物兼容性差、可见光响应弱等局限，尤其在NCL和脱硫反应中的兼容性不佳，限制了其在生物大分子合成中的应用。相比之下，吡啶甲基（Pic）保护基不仅具备优异的水溶性和稳定性，还能高效、快速地对巯基进行后期选择性保护。其突出优势在于，可在温和、水相、近生理条件下实现巯基的无痕脱除，并通过对pH和光照波长的调控，实现对Cys的精准、可控正交去保护，为复杂蛋白质的合成提供了新策略（图1）。

图1. 研究背景

作者系统优化了Pic对Cys巯基保护（caging）和脱除（uncaging）的条件。研究发现，在室温、pH 8.5的磷酸盐缓冲液（PBS）中，4-(溴甲基)吡啶可高效、选择性地保护模型肽中的巯基。通过调节pH、温度或卤代物类型，可进一步提升保护效率（图2A）。脱保护实验表明，使用痕量[Ru(bpy)₃]Cl₂催化剂、抗坏血酸作为还原剂，在pH 5.0的PBS溶液中和10 W白光照射下，可实现巯基的高效无痕释放（图2B）。Pic的电子效应虽对保护过程影响不显著，但对脱保护效率影响明显，强吸电子基团尤为突出。吡啶环上Pic取代基的位置（邻、间、对位）及其取代基的类型也显著影响脱保护效率（图2C）：邻、对位Pic的脱除效率优于间位；吡啶环上的邻、对位取代基对脱除效率影响显著，而间位影响较小。此外，该方法成功应用于牛血清白蛋白（BSA）等复杂体系中Cys的可逆修饰，且蛋白结构保持完好（图2D）。该策略具有条件温和、速度快、位点选择性高及生物相容性好等优点，为蛋白质化学中半胱氨酸的动态调控提供了新工具。

图2. 条件优化和底物拓展

图3. Pic对巯基的正交保护

作者进一步验证了Pic与传统光保护基（如邻硝基苄基和PPZQ）的兼容性。通过精确调节光照波长与pH值，成功实现了同一体系中巯基的正交保护。该方法在模型肽和CCL4蛋白的二硫键定向构建中得到成功应用（图3），克服了传统Cys保护策略在该领域的局限性，展现出在复杂多肽和蛋白质设计中的强大潜力。

图4. Pic在复杂蛋白合成中的应用

为展示其应用价值，作者将Pic介导的Cys巯基可逆保护与一锅多步NCL及EPL-脱硫策略相结合。无需繁琐的中间纯化步骤，即高效组装了复杂糖蛋白白细胞介素-4（IL-4）与肿瘤坏死因子α（TNF-α）（图4）。该方法反应兼容性好、操作简便，显著提高了合成效率和产率。

最后，作者深入揭示了Pic在可见光催化下实现Cys无痕脱除的机理。研究表明，采用Ru(bpy)₃Cl₂作为光催化剂，在光照条件下利用抗坏血酸作为电子供体，可有效驱动光诱导单电子转移反应（荧光猝灭实验证实），进而引发Pic基团裂解。关键机制在于吡啶质子化显著提升了其还原电势，使还原过程得以在温和条件下进行。结合EPR、TEMPO捕获和“自由基钟”等实验，作者确认了picolyl甲基自由基的生成，并阐明C–S键的断裂是通过自旋中心转移实现的，从而为该反应提供了清晰的路径（图5）。

图5. Pic脱保护机理探究

该研究开发了一种基于吡啶甲基（Pic）的半胱氨酸保护与可控释放新策略，为复杂蛋白质合成提供了高效、可控且普适的方法，展现出广阔应用前景，是蛋白质化学领域的一项重要突破。相关成果以“A picolyl-based Cys caging/uncaging strategy facilitates protein synthesis”为题发表于国际著名期刊Angew. Chem. Int. Ed.。上海交通大学药学院助理研究员叶发荣和博士生白晗希为共同第一作者，该工作得到俞飚院士的大力支持，王平教授为通讯作者。

论文链接：https://doi.org/10.1002/anie.202518002

作者： 王平 供稿单位： 药学院