中国农业大学动科学院韩红兵教授团队开发了CRISPR-Cas12i高效多重基因编辑工具

近日，动物科技学院韩红兵教授团队在国际权威期刊 《核酸研究》（Nucleic Acids Research）发表研究论文 《一种用于高效多重基因组编辑的工程化 CRISPR-Cas12i 工具》（An engineered CRISPR-Cas12i tool for efficient multiplexed genome editing）。该研究围绕前沿的 CRISPR 基因编辑技术，通过系统的工程化改造，成功开发出一种高效多基因编辑工具 EOCas12i，在多重基因组编辑应用中展现了良好效果。

高等生物通常依赖于基因调控网络精细控制细胞生理等过程。因此，多基因编辑工具开发，对于基础研究和基因工程的应用都具有重要意义。尽管多种CRISPR-Cas效应因子（如SpCas9、AaCas12b、AsCas12f和LbCas12g）具备核酸酶活性，但普遍缺乏独立加工前体crRNA（pre-crRNA）的能力，或在没有tracrRNA的情况下无法发挥作用。为此，通常需要引入额外的RNA调控元件（如tRNA或核酶）或异源蛋白（如Csy4）实现多基因编辑，在一定程度上限制了其在高效多重基因组编辑中的应用。

CRISPR-Cas12i.3是我校自主知识产权的基因编辑系统。Cas12i.3因体积相对较小（1,045个氨基酸）且PAM要求简单（5′-TTN）而备受关注。然而，已有研究显示其编辑效率较低。此前虽有通过蛋白质突变提升Cas12i.3编辑效率的尝试，但在关键优化策略方面—如crRNA设计、密码子优化以及外切酶融合等仍缺乏系统探索。值得注意的是， 已证明Cas12a在多重基因组编辑中效果显著，Cas12i.3在未经优化时缺乏pre-crRNA加工能力。基于两者的相似性，系统性优化Cas12i.3有望突破这一局限，使其成为一种更为紧凑且具潜力的多基因编辑工具。

根据这一思路，该研究团队通过优化CRISPR RNA（crRNA）设计、密码子使用以及外切酶融合，构建了初步优化的Cas12i（initial optimized Cas12i，IOCas12i）系统。在此基础上，研究团队进一步开展理性设计与氨基酸突变，并通过区域组合开发出高效的增强型优化Cas12i（enhanced optimized Cas12i，EOCas12i）系统，即EOCas12i–Combo1和EOCas12i–Combo2。

通过多维优化组合构建高效EOCas12i系统。研究团队在HEK293T细胞中对八个代表性内源基因位点（ADRB2、CHRM4、FANCF、CXCR4、AR、CD2、GRIN2B和HBB）进行了深度靶向测序，以评估EOCas12i-Combo1和EOCas12i-Combo2的基因编辑能力。结果显示，两种变体在八个位点的平均插入缺失突变频率分别达到64.1%和66.6%，相较野生型Cas12i.3分别提高至2.5–22.8倍和3.0–60.0倍。在CHRM4、FANCF、CD2和HBB等位点，两种EOCas12i变体的编辑效率甚至超过SpCas9。总体而言，EOCas12i-Combo1和Combo2展现出强大且具竞争力的基因编辑性能。

EOCas12i的功能特性。研究发现，IOCas12i和EOCas12i在多个基因位点诱导的缺失片段更大，主要集中在11–40 bp，而Cas12i.3、SpCas9和LbCas12a的缺失多在10 bp以内，尤其是SpCas9。进一步的GUIDE-seq分析表明，在ADRB2位点三者脱靶情况相似，而在CXCR4位点，SpCas9的脱靶次数明显高于EOCas12i-Combo1和Combo2，显示EOCas12i可能具有更好的特异性。为了验证其在动物中的应用，研究团队将EOCas12i-Combo2的mRNA和crRNA显微注射到小鼠受精卵中，移植65枚胚胎后共获得10只幼鼠。结果显示，其中4只（40%）出现了DNMT1位点的插入缺失突变。以上结果证明，EOCas12i表现出较高的特异性，并产生更长的插入缺失，并能够用于基因编辑动物制备。

基于EOCas12i的多重基因组编辑开发。研究团队使用两种CRISPR阵列评估了EOCas12i平台的多重基因组编辑能力：一个20靶点阵列和一个30靶点阵列，分别覆盖12个和17个内源基因位点。结果显示，无论使用20靶点还是30靶点阵列，EOCas12i-Combo1和Combo2在所有靶点均表现出高效编辑，且多靶点编辑主要产生大于10 bp的缺失片段，与单基因编辑的情况一致。总之，EOCas12i-Combo1和Combo2均可实现高效多重基因组编辑。

团队通过本研究申请了国内发明专利5件，国际PCT专利1件，开发的基因编辑系统具有完全自主知识产权。另外，利用该基因编辑系统获得了多基因编辑绵羊，预期EOCas12i–Combo1和EOCas12i–Combo2将成为多重基因组编辑应用的新型高效平台。

中国农业大学动科学院博士后汪林丽为论文独立第一作者，中国农业大学动物学院韩红兵教授为论文唯一通讯作者。中国农业大学已毕业硕士王岩露，在读博士生朱亚宁、秦浩、刘洁和博士后艾越参与了该项研究工作。中国农业大学农学院赖锦盛教授和陈建副教授提供了原始Cas12i.3系统并在研究思路上给予了大力支持。该研究得到了农业生物育种重大专项（2022ZD04013）、内蒙古自治区科技突围项目（2025KJTW0022）、中国农业大学基本科研业务费专项资金项目（2022TC025）以及拼多多-中国农业大学研究基金（PC2023A01004）的资助。