上海交大药学院王平课题组JACS发文：基于吡啶甲基的多肽合成新策略

Fmoc-tBu多肽固相合成策略是沿袭了50多年的传统模式。最终脱除tBu系列保护基使用的三氟乙酸是永久化合物，同时存在脱除的碳正离子产生烷基化副反应、部分保护基难脱除、疏水肽难合成等固有缺点（图1）。脱除Fmoc使用的哌啶为管制化学品, 碱性条件也导致一系列副反应。近期，上海交通大学王平团队针对多肽固相合成的固有缺点，开发了基于吡啶甲基（Picolyl, Pic）的多肽合成新策略。该策略克服了传统SPPS的局限，不依赖强酸、强碱脱除保护基，实现了温和条件下困难多肽的高效合成。

图1. 传统多肽合成

Pic来源广泛、性质稳定，而且具备优异的水溶性。不久前，上海交通大学王平团队开发了Fmoc-Pic策略，实现了对氨基酸侧链官能团（羟基、巯基、氨基、羧基、咪唑、胍基等）的保护，通过光催化实现Pic的高效、温和脱除。Pic在TFA条件下极为稳定，也为氨基酸侧链官能团的正交保护提供了全新方案，能够替代目前已经商业化的带有侧链正交保护基的氨基酸（如Cys, Lys, Ser,  Asp等侧链保护基Dde/ivDde，Mtt，Mmt，Alloc，tButhio/STmp，Allyl，Dmab，2-Phipr ）（J. Am. Chem. Soc. 2025, 147, 34011−34018）。同时，Pic还能实现蛋白质巯基的正交保护，以及光催化条件下的温和脱除，为复杂蛋白质的高效合成提供了新策略（Angew. Chem. Int. Ed. 2025, e202518002）。近日，该团队进一步将吡啶甲氧羰基（Picoc）代替叔丁氧羰基（Boc）和9-芴甲氧羰基（Fmoc）作为氨基酸a氨基保护基，发展了一种绿色固相多肽合成新策略—Picoc-SPPS。以题为“Sustainable Peptide Synthesis by Photoredox-Catalyzed Picoc-SPPS”发表于Journal of the American Chemical Society。

多肽类药物因其高活性、高靶向性和良好的安全性而备受关注。目前，肽类药物主要通过液相多肽合成（LPPS）或固相多肽合成（SPPS）制备，且SPPS已成为实验室研究和工业生产的核心技术。多肽合成的关键在于氨基酸a氨基的缩合与脱保护。目前最广泛使用的a氨基保护基是Boc和Fmoc，需分别借助三氟乙酸（TFA）和哌啶进行脱除（图2a）。由于高腐蚀性和高毒性氢氟酸的使用而限制了Boc-SPPS的应用。Fmoc-SPPS虽因条件温和成为主流，但哌啶除受到监管限制外，还容易导致天冬酰亚胺（aspartimide）和二酮哌嗪（diketopiperazine）等副产物的形成。此外，庞大且疏水的Fmoc基团也带来了原子经济性和溶解性等方面问题。因此，开发一种能实现温和条件下选择性脱保护的新型α-氨基保护基已成为当务之急。

图2. 研究背景

为解决传统SPPS存在的缺陷，尽管已有多种替代保护策略被报道，但仍无法与Fmoc-SPPS在效率和广泛适用性方面相媲美，尤其是在长肽的合成方面。此前，作者所在课题组证明了吡啶甲基（Pic）可作为氨基酸侧链通用的光脱保护基团，以及通过pH和波长调控实现巯基的正交保护。基于此，作者将其应用于对α-氨基的保护，推出了Picoc-SPPS策略（图2b）。在温和的可见光介导的光氧化还原催化条件下，能够实现Picoc保护基的高效选择性脱除，避免了哌啶等强碱性试剂的使用，有效抑制了相关副反应的发生。Picoc-SPPS不仅能与水等绿色溶剂相兼容，而且光催化剂的固定可实现了催化剂的循环利用，进一步提升了可持续性。该策略可作为传统SPPS的一种通用的、可规模化且环境友好型的替代方案，具有广阔的应用前景。

图3. Picoc-氨基酸砌块的合成

作者首先对Picoc保护氨基酸切块进行了合成，以侧链保护氨基酸与Picoc羰基咪唑活性酯1反应，通过简单的萃取、沉淀和重结晶，成功实现了Picoc氨基酸库的高效构建（图3）。Picoc-氨基酸合成简单，稳定性和水溶性好。

图4. 液相Picoc脱除条件优化

随后，作者以Picoc-L-Trp(Boc)-OH（20）为模型底物，建立了液相Picoc脱除的最佳条件。以Ru(bpy)3Cl2为光催化剂，抗坏血酸为还原剂，在PBS/MeOH ( pH 5.0) 溶剂体系中，使用LED节能灯（CFL, 10 W）照射20分钟即可实现Picoc的完全脱除（图4）。各种Picoc-氨基酸在最佳条件下均表现出优异的光催化脱保护效果。

图5. 固相Picoc脱除条件优化

作者将该策略拓展至固相体系。以Wang树脂负载的亮氨酸脑啡肽（30）为模型底物进行考察，以fac-Ir(ppy)3 (PC 2)为光催化剂，汉斯酯为还原剂，在含甲酸添加剂的DMF/H2O (9:1, v/v)溶剂体系中，使用蓝色LED（450nm, 40 W）照射30分钟可实现Picoc的完全脱除（图5）。反应能够兼容DCM、THF和MeCN等常规溶剂，以及γ-戊内酯、2-甲基THF等绿色溶剂。该固相Picoc脱除条件表现出高效、实用和高度兼容的特点，在固相多肽合成中具有潜在的应用。

图6. Picoc-SPPS策略在多肽合成中的应用

作者基于Picoc-氨基酸发展了无需哌啶参与的固相多肽合成新策略—Picoc-SPPS，经缩合-脱Picoc迭代反应，实现目标肽的合成。作者通过该策略完成了一系列药物肽（32-41）的合成（图6a）。鉴于Picoc- 氨基酸水溶性的改善，作者进一步将Picoc-SPPS策略拓展至水相体系，通过水相Picoc-SPPS策略实现了一系列药物肽（42-45）的制备（图6b）。

图7. 固定催化剂的Picoc-SPPS策略在多肽合成中的应用

为提升催化剂的利用效率，作者通过固定催化剂，实现了Picoc-SPPS过程中催化剂的高效回收与循环利用。合成过程均表现出较高的效率（图7）。以上实验结果进一步验证了Picoc-SPPS策略在绿色多肽合成中具有广阔的应用前景。

图8. 外消旋化副反应研究

作者还发现，Picoc-氨基酸的外消旋化程度与Fmoc-氨基酸无显著差异，这表明Picoc保护基可作为Fmoc的可靠替代保护基用于多肽合成。

图9. Aspartimide和diketopiperazine副反应研究

为评估Picoc-SPPS对aspartimide副反应的抑制效果，作者以包含Asp-Gly序列的六肽（65）为模型底物，分别使用Fmoc-SPPS和Picoc-SPPS进行对比合成。实验结果表明，Picoc-SPPS策略能完全杜绝aspartimide副产物的生成；相比之下，在Fmoc-SPPS策略中，该副产物的生成占比高达约8%（图9a）。此外，在针对diketopiperazine形成的对比研究中（图9b），Picoc-SPPS策略显著优于Fmoc-SPPS，将副产物比例从后者的91%降至极低水平。这表明Picoc-SPPS能同时高效抑制aspartimide和diketopiperazine的生成。

图10. Picoc脱保护反应机理研究

最后，作者对Picoc脱保护反应的机理进行了深入研究（图10）。通过TEMPO捕获实验，确定了4-甲基吡啶自由基的生成。Stern-Volmer荧光淬灭实验表明，激发态的光催化剂PC2是由汉斯酯淬灭的。紫外-可见吸收光谱证实反应体系中无EDA复合物形成。综合上述结果，作者提出了可能的反应机制：[IrIII]（PC2）经蓝光照射转化为激发态[IrIII]*，经汉斯酯A还原，生成自由基阳离子B与[IrII]。质子化的中间体D随后被[IrII]还原得到中间体E，E发生均裂生成自由基G与中间体F，F释放一分子CO2得到游离胺H。最终，G可通过SET/H+或HAT两种途径被还原，得到吡啶衍生物I与J。

综上，本研究开发了基于光氧化还原催化的Picoc-SPPS策略，有效解决了传统SPPS方法的局限性——对强酸强碱的依赖以及由其引发得副反应。通过水相合成拓展和催化剂固定，实现了多肽的绿色合成，从而确立了Picoc-SPPS作为一种兼具稳定性和高选择性的环境友好型的多肽合成方案，为现代多肽药物开发提供了新选择。

该课题获得国家自然科学基金、国家重点研发计划和上海市抗体药物偶联重点实验室等项目的资助。

论文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.5c17715

作者： 王平 供稿单位： 药学院